【产品名称】
通用名称：日本乙型脑炎病毒检测试剂盒（实时荧光PCR法）
英文名称：Japanese encephalitis virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒 & 50T/盒
【预期用途】
本试剂盒利用实时荧光PCR原理，定性检测乙型脑炎病毒，对乙型脑炎病毒引起的感染及其并发症的诊断及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对JEV基因组高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含JEV基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
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序号 |
组成 |
25T/盒 |
50T/盒 |
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1 |
JEV RT-PCR反应液 |
375 μL×1管 |
750 μL×1管 |
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2 |
JEV逆转录酶 |
50 μL×1管 |
100 μL×1管 |
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3 |
JEV Taq酶 |
75 μL×1管 |
150 μL×1管 |
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4 |
JEV阳性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
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5 |
JEV阴性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
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6 |
说明书 |
1份 |
1份 |
注：阴性对照为人基因组DNA，阳性对照为失去活性的JEV cDNA。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1.从血清或脑脊液获取样本。
2.应避免标本间交叉污染。
6.样品如不及时检测，应于-20℃至-80℃冻存。标本运输应于冷冻条件下进行
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
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单反液配制表(每份) |
RT-PCR反应液 |
15.0 μL |
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逆转录酶 |
2.0 μL |
|
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Taq酶 |
3.0 μL |
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
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反应体积 |
25 μL |
通道选择 |
FAM通道采集JEV 荧光信号 |
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PCR 反应 条件 |
步骤 |
条件 |
循环数 |
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反转录 |
42℃：10分钟（min） |
1 |
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预变性 |
95℃：3分钟（min） |
1 |
|
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预扩增 |
95℃：5秒（s） |
5 |
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55℃：40秒（s） |
|||
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PCR扩增 |
95℃：5秒（s） |
40 |
|
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55℃：40秒（s） （此阶段结束时采集荧光信号） |
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。
【参考值（参考范围）】
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