一、试剂准备
Hoechst 33258染色液的配置是关键，储存液通常浓度为1mg/mL，需在避光条件下保存，以防止染料降解。工作液则是将储存液按比例稀释至适当浓度，一般为10μg/mL，除此之外，还需准备PBS缓冲液和细胞固定液等，常用的固定液有甲醇：冰乙酸（3:1）混合液，这种固定液能够迅速固定细胞形态，或4%的多聚甲醛溶液，这种固定液则更为温和，适用于不同类型的细胞。封片液的选择也不可忽视，好的封片液能够确保样本在显微镜观察时保持稳定，避免干燥和气泡的产生。

二、染色步骤
1、细胞培养：取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟以上，置无菌超净台内吹干后，再用PBS溶液洗涤两遍、细胞基础培养液洗涤一遍。将盖玻片至于六孔板内，种入细胞培养，待细胞密度生长至60%--85%左右。

2. 细胞固定：将准备好的细胞样本放入细胞固定液中，在4℃条件下固定5分钟。这一步需要严格控制温度和时间，以确保细胞固定效果最佳。如果使用4%多聚甲醛溶液，固定时间可以延长至15分钟，以充分固定细胞结构。

3. 细胞洗涤：固定后的细胞需要用PBS缓冲液浸洗3次，每次3分钟，洗涤时可以用摇床，或手动左右轻轻摇晃，这一步旨在去除多余的固定液，确保细胞表面清洁，染出来的细胞就会美美哒。

4.染色：将Hoechst 33258染色液滴加到细胞样本上，确保染色液能够完全覆盖住样品。对于已经固定的细胞，室温下孵育10分钟通常可以达到较好的染色效果；而对于活细胞，则需要在适宜的培养温度下孵育20-30分钟，以确保染料充分进入细胞核，与DNA结合。染色完成后，同样需要用PBS缓冲液浸洗3次，每次3分钟，洗涤时使用摇床或者手动摇晃，以去除未结合的染料，避免背景荧光的干扰。

5.封片：滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡，使细胞接触封片液，切勿弄反。

三、观察与分析
在荧光显微镜下观察染色后的细胞样本。活细胞的细胞核通常呈现弥散、均匀的蓝色荧光，这是由于Hoechst 33258染料与DNA结合后发出的荧光，这种荧光信号强度适中，分布均匀。而坏死细胞由于细胞膜完整性破坏，通常不被Hoechst染色，表现为无荧光或荧光极弱。凋亡细胞的细胞核或细胞质内会出现浓染致密的颗粒块状蓝色荧光，并且可以观察到明显的核形态变化，如核碎裂、核固缩等。如果观察到3个或3个以上的DNA荧光碎片，则可以判定为凋亡细胞，这一特征是凋亡细胞的重要标志。

注意事项：
1. Hoechst 33258染色液对光敏感，因此在保存和使用过程中应严格避光，以防止染料降解，影响染色效果。
2. 细胞固定和洗涤步骤必须充分，任何残留的固定液或未结合的染料都可能影响染色效果，导致实验结果不准确。
3. 封片时务必确保封片液完全覆盖样品，避免气泡和干燥，以保证观察的清晰度。
4. 在荧光显微镜观察时，选择合适的激发和发射波长也非常重要，这能够帮助获得最佳的荧光效果，从而更准确地分析细胞状态。