基因敲除的概念

基因敲除，又称为基因打靶，是一种基因工程技术，通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。基因敲除技术的优点是位点准确、成功率高，并且有很广泛的应用，可用于微生物、动植物的品种改良，创建生物膜性、疾病机理研究、免疫应用、精准医疗（遗传病的靶向治疗）等。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，现阶段技术比较成熟的有CRISPR/Cas9基因编辑技术。

微生物中的基因敲除

在微生物领域，基因敲除除了可以用来进行菌种改良，还常常用来研究基因功能。微生物的基因组研究非常重要，微生物中的酶基因和代谢过程相关的功能基因，可能对整个现代生物科技、工业和农业发展都起到推动作用，比如抗生素的研发、工业用酶的发现、微生物发酵行业等。微生物基因敲除，常用的主要有两种方法，一种是基于同源重组系统，另一种是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术。

细菌基因组编辑技术。

1基于同源重组系统

同源重组是指减数分裂或者有丝分裂的过程中，相同或者相似的DNA序列间发生交叉互换的现象。基于同源重组系统的微生物基因组编辑技术实验流程简单，利用限制性内切酶、连接酶和PCR技术等就可以对DN**段或者质粒等基因组进行改造，实现基因敲除、敲入、突变等一系列修饰操作。

细菌基因敲除的传统方法是利用自身的Rec系统对外源进入的DNA进行同源重组，从而实现目标基因的等位替换。通过设计靶基因的同源融合片段，将其克隆至**载体中，**载体通过接合输入到靶细菌。通过抗生素筛选细菌基因组靶位点整合有**载体的插入突变株。在第二轮反向选择压力下，只有细菌基因组发生第二次同源重组并丢失**质粒的细菌才可以存活。最后通过PCR鉴定即可获得目的基因的缺失突变株。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术

CRISPR-Cas9作为先进的基因编辑技术，在微生物基因组改造方面有着明显的优势，该方法速度快，无痕，便于后续研究。需要重点提及的是CRISPR/Cas微生物基因敲入系统，它是在Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。同源性定向修复（HDR）途径，对比NHEJ修复途径，同源性定向修复（HDR）途径是更为准确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。这种Cas9 系统结合其它的基因工程技术，用于对基因组中目标DNA 进行改造，必将在生物、农业、环境研究及医学领域有着广泛的应用前景。

CRISPR/Cas9系统技术原理。

研究对象

大肠杆菌、沙门氏菌、链霉菌、梭菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、丝状真菌等。

服务优势

• 无痕编辑
• 有效精准
• 多基因编辑：能同时敲除多达3个基因
• 便于筛选：不要求靶细菌具有抗生素抗性
• 定制服务：公司可以代为开发针对该物种的CRISPR基因组编辑系统或利用常规同源重组方法的基因组编辑系统

客户提供信息
• 需改造的菌株及信息
• 靶基因的名称或靶序列

点击该网址查看更多服务细节：https://www.abace-biology.com/Knockout-gene-knockout-cell-line-service.htm

参考文献：

阳燕, 杨英明, 胡涛. 原核微生物基因敲除策略的研究进展[J]. 国际口腔医学杂志, 2016, 43(5).

Mojica, F. J. M., & Montoliu, L. (2016). On the Origin of CRISPR-Cas Technology: From Prokaryotes to Mammals. Trends in Microbiology, 24(10), 811–820. doi:10.1016/j.tim.2016.06.

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