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Nat Commun（IF:14.919） | 双管齐下，让癌细胞插翅难逃！DIA磷酸化助力发现T-ALL白血病新药靶

作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-23T19:16 (访问量:3139)

T细胞急性淋巴细胞白血病 (T-ALL) 是一种侵袭性血液恶性肿瘤，其中约有75%的病例是由Notch1基因突变导致的，因此Notch1的抑制剂GSI常被用作该病的靶向用药。然而，临床上常出现原发性耐药或复发性耐药，这大大限制了GSI作为T-ALL靶向用药的临床效果。

2021年5月丹麦哥本哈根大学Jesper V. Olsen团队在Nature Communications（IF:14.919）杂志上发表题为《Proteomics of resistance to Notch1 inhibition in acute lymphoblastic leukemia reveals targetable kinase signatures》的研究成果，利用蛋白组和DIA磷酸化修饰蛋白组找到了不同耐药细胞共同的特征和新的药物靶点。

【研究材料】

1. 固有耐药模型：对GSI药物具有固有耐药的3种细胞系JURKAT、MOLT-3、PEER，药物敏感的3种细胞系DND-41、HBP-ALL、ALL-SIL；

2. 获得性耐药模型I：从药物敏感细胞系DND-41中筛选获得性耐药细胞株（persister cells）；

3. 获得性耐药模型II：从两例临床患者中分离到药物敏感癌细胞系，利用PDX（patient-derived xenografts）小鼠模型筛选获得性耐药细胞株。

【技术方法】

蛋白组、DIA磷酸化修饰蛋白组

实验方法简介

🔹 步骤1：建立3种GSI耐药模型，采用蛋白组和DIA磷酸化组分析分子水平变化；

🔹 步骤2：分析GSI固有耐药模型的分子变化特征；

🔹 步骤3：分析GSI获得性耐药模型的分子变化特征；

🔹 步骤4：寻找模型间的耐药调控共性，激酶底物分析找到关键激酶PKC，验证其调控机制；

🔹 步骤5：以PKC为新靶点，探讨与Notch1抑制剂联合用药的效果。

研究结果

1. 建立GSI耐药模型

为了探索T-ALL癌细胞对GSI产生固有耐药（Intrinsic resistance）和获得性耐药（acquired resistance）是否有共同的分子基础，研究者建立了三种GSI耐药模型。固有耐药模型比较了耐药细胞系JURKAT、MOLT-3、PEER和药敏细胞系DND-41、HBP-ALL、ALL-SIL。获得性耐药采用了两种模型，第一种模型是利用敏感细胞系DND-41筛选获得性耐药细胞株（persister cells），第二种模型是从两例临床患者中分离到药物敏感癌细胞系，利用PDX小鼠模型筛选获得性耐药细胞株。研究者利用蛋白组学和DIA磷酸化修饰蛋白组学分析了三种模型的分子应答异同。

图1 GSI固有耐药模型和获得性耐药模型的组学分析流程

2. GSI药物固有耐药模型中的分子调控特征

GSI药物敏感细胞系和耐药细胞系的蛋白表达模式存在显著不同，共发现596个差异表达蛋白，其中323个蛋白在耐药细胞系中表达丰度更高。结合转录调控数据库ChEA发现，这些差异蛋白存在两个调控簇，预测其主调控因子分别是Notch1和Tal1。

GO富集分析发现，差异蛋白功能主要集中在氨基酸代谢、脂肪酸降解、活性氧清除等过程。将差异蛋白在药物响应数据库CMap比对发现，细胞对GSI药物敏感性应答与蛋白合成抑制剂伊米丁和mTOR抑制剂的表达特征相似性最高。与之相契合的是，在磷酸化修饰组中差异修饰的蛋白功能也显著富集了mTOR信号传导和蛋白翻译调控等途径。这表明，癌细胞对GSI的耐药性可能通过抑制mTOR信号传导或蛋白合成来实现逆转。

图2 GSI耐药细胞系在蛋白和磷酸化修饰水平的变化

3. GSI获得性耐药模型中的分子调控特征

比较GSI敏感DND-41亲代细胞（parental cells）及其衍生的耐药细胞株（persister cells）蛋白表达差异发现，Myb、Brd4、cMyc等主调控因子在耐药细胞株中上调表达，其他上调表达的蛋白还参与活性氧清除、氧化呼吸、蛋白合成等，这些与固有耐药细胞系的情况相似。利用PDX模型筛选的耐药细胞系（PDTALL11、PDTALL19）也出现了相似的改变。

图3 获得性耐药细胞系的蛋白和磷酸化修饰差异

4. 激酶-底物富集分析（KSEA）找到关键的耐药调控途径

为了找到共同的调控方式，研究者利用KSEA算法分析了3种模型下GSI耐药和敏感细胞中存在的激酶-底物调控模式，结果发现Akt1、PKC家族等激酶显著富集，在耐药细胞系中十分活跃。进一步实验证实三个耐药模型中的PKCδ在蛋白水平和磷酸化水平均上调表达，且表达水平与核糖体S6蛋白磷酸化水平正相关。用PKCδ的抑制剂处理后，细胞系中S6磷酸化水平显著下调。

图4 激酶PKCδ在耐药细胞系的调控作用

5. 同时抑制Notch和PKC降低了耐药T-ALL细胞的存活率

进一步实验发现Notch通过cMyc正调控S6蛋白功能，促进细胞蛋白合成。在药物敏感细胞系中，GSI 抑制Notch活性进而下调S6蛋白；而在耐药细胞系中，PKCδ活性异常升高，促进S6蛋白的磷酸化从而解除了GSI所抑制的蛋白合成，形成细胞耐药性。作者对耐药细胞系中同时加入Notch的抑制剂GSI和PKCδ的抑制剂sotrastaurin，结果证实，联合用药显著抑制了耐药细胞的生长，并促进了耐药细胞的凋亡。这说明抑制PKCδ活性可以恢复耐药细胞对GSI的敏感性。

图5 Notch和PKC联合抑制效果

小编小结
肿瘤治疗已经有了长足进步，针对一些关键驱动基因已经有了很好的靶向药物治疗，但肿瘤细胞对药物的耐药性是目前所面临巨大挑战。在肿瘤形成过程中可能存在固有耐药性，在治疗过程中则可能产生获得性耐药。本研究比较T-ALL肿瘤在不同条件下产生的对靶向药物GSI的耐药性模型，通过蛋白组学和DIA磷酸化修饰组学系统分析，找到了这些模型共通的耐药分子响应特征，利用激酶-底物富集分析发现了关键激酶PKCδ及其调控靶点S6核糖体蛋白，解析了耐药机制，最终发现了新的肿瘤治疗靶点和更有效的联合疗法，为克服T-ALL治疗中GSI耐药性提供了可能。

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