2022年5月11日，武汉大学孙蒙祥教授在《The Plant Cell》杂志在线发表关于表观遗传调控决定拟南芥生殖细胞和营养细胞的不同命运相关研究文章。研究发现，H3K27me3是决定这两种细胞不同命运的关键因素。

众所周知，拟南芥这类被子植物的小孢子经过有丝分裂可以产生营养细胞（VC）和生殖细胞（MG Cells，MG cells包含GC和SC细胞，本文以SC细胞为研究对象）。先前的研究表明，VC和MG cells存在不同的基因表达模式，也有着不同的DNA甲基化模式，但是并没有揭示VC和MG cells不同分化路径的关系。本篇文献利用CUT&Tag、ATAC-seq、RNA-seq等组学技术，并联合细胞学揭示VC和MG cells的关系，即在MG cells发生了H3K27me3的擦除，而VC则继承了小孢子H3K27me3。

在该项研究中，近岸蛋白CUT&Tag技术pA-Tn5转座体（升级后为pAG-Tn5转座体，货号：M059）助力揭示H3K27me3在VC和MG cells中的不同修饰。

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前期先前关于H3K27me3甲基化的研究引起孙蒙祥教授课题组的注意，既然H3K27me3可能是关键影响因素，那么首先需要得要证明H3K27me3在VC和MG cells中是否真的存在差异。与此同时，也构建了H3K27me3擦除转基因植株（REF-6介导的擦除，转基因植株统一代号为TL），观察野生型和转基因植株中VC、MG cells的H3K27me3分布差异。H3K27me3免疫荧光发现野生型植株VC细胞核（VN）中能够检测出信号，但是MG cells的SC细胞核（SN）不能检测出信号，当然，TL植株中是无法检测H3K27me3的免疫荧光信号的（图1）。这表明H3K27me3在VC和MG细胞中存在差异。

图1.野生型和TL转基因植株VN、SN的H3K27me3免疫荧光检测

既然H3K27me3在VC中被检测出，那么其是如何调控VC命运的呢？研究人员观察了H3K27me3擦除植株TL的表型，结果发现花粉囊泡组织异常且无法形成、花粉管破裂、雄性生殖单位破坏，而雄性生殖单位常常被认为是功能性VC的重要标志。

由此以上可知，H3K27me3存在于VC中并且对其功能特异性至关重要。但是，H3K27me3是如何调控VC、MG cells命运的呢？根据先前的研究发现，TL植株花粉粒表型与VC-异常DUO1基因表达株系的类似，VC中H3K27me3的擦除可能将其转变为MG cells。为了证实这一点，研究员检测了TL植株和野生型植株的VC细胞是否含有MG cells标志物，结果在TL VC中检测出MG cells标志物HTR-10PFP，野生型植株VC中没有检测出（图2）。另外，仅在在MG cells的SC中H3K9me2高度富集促进染色质缩合。研究院人员发现野生型植株SC细胞核（SN）和TL VC细胞核（VN）中H3K9me2富集度相似（图2）。以上两个实验表明，VC中H3K27me3的擦除促进VC向MG cells转变。

图2.在野生型和TL植株VC细胞核（VN）、MG cells的SC细胞核（SN）中检测HTR10-RFP标志物和H3K9me2

研究人员进一步从染色质层面上探索H3K27me3对VC和MG cells命运的影响。利用CUT&Tag技术在WT VCs中获取6950个H3K27me3 Peak，WT SCs中获取694个H3K27me3 Peak，TL VCs获取141个H3K27me3 Peak。即TL VCs的H3K27me3的分布状态与 WT SCs的类似，且TL VCs发生了染色质层面上的变化。随后，研究员利用ATAC-seq技术探索染色质开放状态的变化。ATAC-seq生信分析的数据表明，与VC-Peak相关的注释基因在WT SCs、TL VCs中较少而WT VCs中较多。与此相对，与MG-Peak相关的注释基因在WT SCs、TL VCs中较多而WT VCs中较少。同时也发现，与MG-Peak相关的注释基因被H3K27me3广泛地抑制。CUT&Tag和ATAC-seq分析都表明TL VCs和WT SCs的染色质状态相似而与WT VCs染色质状态差异较大，即VC中H3K27me3的擦除导致染色质重塑（图3）。

图3.野生型和TL植株VC、SC细胞染色质状态的研究

染色质状态的变化导致VC、MG cells各自的命运，那么到底是哪些基因协助这一命运形成的呢？研究员随后做了RNA-seq进行转录组分析，注释了一系列与VC、MG cells形成相关的基因。结果发现，与WT VCs相比，TL VCs中与VC-Peak关联的基因表达水平下调而与MG-Peak关联的基因表达水平上调，即TL VCs的基因表达模式与MG cells的类似。qpcr荧光定量分析也证实这些注释的基因在WT VCs、TL VCs、MG cells中的表达情况。

作者利用多种技术经过一些列实验证实了H3K27me3对于VC的身份维持至关重要，一旦擦除H3K27me3将推动VC向MG cells转变。

CUT&Tag技术是一种新兴的DNA-蛋白质互作研究方法，是用来取代传统的ChIP-seq技术来探索组蛋白修饰区域、转录因子结合状态以及全基因组范围内DNA-蛋白质互作情况。2019年7月近岸蛋白质（Novoprotein）开发出CUT&Tag试剂盒，仅仅一个试剂盒就可以完成从靶蛋白结合DN**段的获取到测序文库的构建。经过不断的创新优化,CUT&Tag试剂盒已经从CUT&Tag 1.0、CUT&Tag 2.0迭代至CUT&Tag 3.0。CUT&Tag 3.0在原来基础上进一步优化，提升转座体的切割效率、配备实验检查体系、高效的小片段DNA提取磁珠等，以保证CUT&Tag实验的高效进行。

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